3. “Protein-Profiling“ – ein neuer Ansatz in der Toxikologischen Forschung

Hintergrund der Methode

Im Laufe des “Human Genome Projects“ (Genomics) hat man schnell erkannt, dass die Gesamtheit aller Gene nur eine limitierte Aussage über zelluläre Reaktionsmechanismen auf externe Stimuli erlaubt, da kein Organismus alle kodierten Proteine gleichzeitig benötigt. Während das Genom das komplette Programm einer Zelle enthält und eine Konstante darstellt, reflektiert das Proteom (Proteomics) eine hochvariable, dynamische Momentaufnahme aller exprimierten Proteine einer Zelle zu einem exakt definierten Zeitpunkt. Im Zentrum dieses Ansatzes steht die Methode der hochauflösenden differentiellen 2-dimensionalen Protein-Gelelektrophorese. Hiermit können bis zu 10.000 Proteine gleichzeitig aufgetrennt, sequenziert oder durch Massenspektrometrische Verfahren (z.B. MALDI-TOF) auf Addukte analysiert werden.
Die vergleichende (z.B. Noxe vs. Kontrolle) Proteomanalyse zur Charakterisierung von Wirkmechanismen toxikologisch bedenklicher Schadstoffe durch diese neue Methode liefert eine klar strukturierte Grundlage dafür, dass toxikologische Untersuchungen auf ein eindeutiges und rationelles Niveau gehoben werden können. Dadurch lassen sich einerseits Tierversuche stark reduzieren und gleichzeitig der Informationsgehalt drastisch steigern. Selbst die Identifizierung von nicht-kodierenden Gensequenzen, zum Beispiel gewebespezifischer oder physikalisch bzw. chemisch induzierbarer Promotoren ist durch subtraktiven Vergleich gewebespezifischer Proteine möglich.

Die Methode ist in unserem Labor schon seit mehreren Jahren etabliert. Z.B. konnten wir zeigen, daß die Exposition verschiedener Zell-Linien mit Daunorubicin zu einer verstärkten Expression einiger “heat shock“-Proteine und Chaperone führt (Möller et al. 1999), also von zellulären Proteinen, die zum Schutz, zur Stabilisierung und Faltung von Rezeptoren, Enzymen und zellulären Strukturproteinen wichtig sind.

“Protein-Profiling“ – ein neuer Ansatz in der Toxikologischen Forschung Abb. 2: “Protein-Profiling“. Das Protein-Muster von behandelten und unbehandelten Zellen wird über die 2-dimensionale Gelelektrophorese verglichen. Differentiell exprimierte Protein-Spots werden ausgeschnitten und über N-terminale Sequenzierung oder MALDI-TOF identifiziert

3.1 Zelluläre Reaktionsmechanismen bei der Entstehung umweltbezogener Erkrankungen unter Berücksichtigung von Summationseffekten

Unvorhersagbar ist bislang die Kombinationswirkung von Schadstoffen. Die Verbindungen können sich im Organismus in neue Produkte mit völlig anderen toxikologischen Eigenschaften umwandeln und sich in ihrer Wirkung gegenseitig noch verstärken (synergistisch-potenzierender Effekt). Richt- und Grenzwerte beziehen sich immer nur auf Einzelsubstanzen. Außerdem scheinen genetische Prädispositionen eine zusätzliche Rolle zu spielen. Eigene Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Vielfalt Schadstoff-induzierter zellulärer Reaktionen durch die Beeinträchtigung genereller Signalwege ausgelöst werden kann (Apoptose, Entzündung, intrazelluläre Signalwege, Aktivierung von Protoonkogenen und Transkriptionsfaktoren). Mittels des Protein-Profilings über die 2-dimensionale Gelelektrophorese, kombiniert mit Micro-Array Technologien, wird z.Zt. ein System etabliert, mit dem diese Problematik untersucht werden kann.

In der Konzeption wäre ein mögliches Ziel die Weiterentwicklung dieser Methode als Testsystem zur Identifizierung von neuen Biomarkern und das Aufdecken von Zusammenhängen bei der Exposition von Schadstoffen. Die Befunde könnten in epidemiologischen Studien eingesetzt und zusammen mit den experimentell gewonnenen Daten zur Risikoevaluierung einer Exposition eingesetzt werden.

3.2. Aufklärung von Resistenzmechanismen in der Chemotherapie von Tumoren

Bei der Entstehung einer Resistenz gegenüber einem Chemotherapeutikum handelt es sich meist um ein multifaktorielles Geschehen, an dem mehrere zelluläre Mechanismen gleichzeitig greifen. In Zellkultur-Systemen mit verschiedenen Tumor-Zellinien studierten wir zunächst die enzymatische Inaktivierung von Anthracyclinen. Hier fanden wir, daß einige cytosolische Carbonyl-Reduktasen durch Daunorubicin-Vorbehandlung verstärkt exprimiert werden und bei der Resistenz-Entstehung von Tumoren gegen Anthracycline beteiligt sind. Diese Enzyme sind durch pflanzliche Flavonoide hemmbar, und deren Einsatz in der Tumortherapie zur Resistenzüberwindung scheint durchaus möglich. Wir versuchen nun, mittels der differentiellen 2-dimensionalen Gelelektrophorese von Daunorubicin-resistenten und -sensiblen Tumorzellen, neue, bislang unbekannte Faktoren einer Chemotherapie-Resistenz zu finden. Hier haben wir Hinweise darauf bekommen, dass die Multifaktorialität einer Resistenz-Entstehung u.U. damit begründet ist, dass durch das Chemotherapeutikum zentrale Moleküle der Zellregulation modifiziert werden (Möller et al., 2002).

Ausgewählte Literatur zum Thema

1. Soldan M, Netter KJ and Maser E: Induction of daunorubicin carbonyl reducing enzymes by daunorubicin in sensitive and resistant pancreas carcinoma cells.
Biochem Pharmacol 51: 117-123, 1996.

2. Soldan M, Netter KJ and Maser E: Enzymatic detoxification of daunorubicin as supplementary mechanisms to multidrug resistance.
Exp Toxic Pathol 48: 370-376, 1996.

3. Soldan M and Maser E: Metabolic inactivation and efflux of daunorubicin as complementary mechanisms in tumor cell resistance.
Adv Exp Med Biol 414: 537-544, 1997.

4. Koch L, Maser E and Soldan M: Alterations in the expression of daunorubicin phase-I metabolism in different carcinoma cell lines.
Adv Exp Med Biol 463: 545-551, 1999.

5. Soldan M, Ax W, Plebuch M, Koch L and Maser E: Cytostatic drug resistance: role of phase-I daunorubicin metabolism in cancer cells.
Adv Exp Med Biol 463: 529-538, 1999.

6. Ax W, Soldan M, Koch L and Maser E: Development of daunorubicin resistance in tumour cells by induction of carbonyl reduction.
Biochem Pharmacol 59: 293-300, 2000.

7. Ifferth T, Soldan M, Moeller A and Maser E: Modulation of daunorubicin toxicity by liposomal encapsulation and use of specific inhibitors in vitro.
Toxicology 144: 189-195, 2000.

8. Möller A, Soldan M,Völker U and Maser E: Two-dimensional gel electrophoresis: a powerful method to elucidate cellular responses to toxic compounds.
Toxicology 160: 129-138, 2001.

9. Möller A, Malerczyk C, Völker U, Stöppler H and Maser E: Monitoring daunorubicin- induced alterations in protein expression in pancreas carcinoma cells by two-dimensional gel electrophoresis.
Proteomics 2: 697-705, 2002.